1 ФГБОУ ВО Московский ГУПП;
2 ФГБНУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова
Основополагающее значение в микробиологической практике играют питательные среды различного назначения и состава [1 – 4]. Правильно подобранный состав питательных сред обеспечивает возможность выделения микроорганизмов, получения чистых культур, изучения биологических свойств и идентификации. Для культивирования микроорганизмов используют различные по составу питательные среды. Несмотря на существующий современный инструментальный анализ, различные тест-системы, молекулярно-генетические ускоренные методики выявления микроорганизмов, классические методы, используемые в бактериологической практике, остаются «золотым стандартом», хотя требуют длительных исследований. На сегодняшний день имеется широкий ассортимент коммерческих отечественных и импортных питательных сред. Однако универсальных сред, абсолютно пригодных для культивирования всех микроорганизмов, не существует. Поэтому проводятся исследования по оптимизации ранее созданных и конструированию новых питательных сред с учётом современных представлений о метаболизме бактерий и особенностей характеристик, обнаруженных у микробов [4]. В последние годы при выявлении сальмонелл с целью ускорения исследования и значительного сокращения объёма рутинной работы в современной лабораторной практике применяются дифференциально-диагностические среды нового поколения – хромогенные питательные среды, принцип действия которых основан на проявлении в реакциях специфически активных ферментов микроорганизмов. Для идентификации микроорганизмов в состав среды включают хромогенный субстрат – высокомолекулярное синтетическое вещество, при расщеплении которого специфическим ферментом бактерий образуются окрашенные флюоресцирующие продукты (хромофоры), способные окрашивать микробные колонии. Подбор адекватных хромогенных компонентов позволяет выявлять разные ферменты бактерий, и, следовательно, избирательно окрашивать колонии разных микроорганизмов [5 – 9, 14].
Использование хромогенных питательных сред обеспечивает в течение 18 – 24 час. одноэтапное выделение и идентификацию микроорганизмов, имеющих важное значение для клинической и санитарной микробиологии: сальмонеллы, типичные E. Coli и энтерогеморрагические эшерихии, колиформные бактерии, энтерококки, стафилоккокки, клостридии, псевдоманады и др. [6, 8, 9].
В 1979 г. Ален Рамбах предложил и запатентовал способ использования специальных хромогенных субстратов для выделения и одновременной идентификации патогенных микроорганизмов [9, 14]. Хромогенные среды фактически являются разновидностью дифференциальных питательных сред [15 – 22].
В 1993 г. А. Рaмбах основал в Париже фирму, специализирующуюся на выпуске хромогенных сред, под торговой маркой CHROMagar™. Идея оказалась очень плодотворной, и вскоре большинство микробиологических фирм включилось в разработку хромогенных сред [6 – 10, 14].
Для ускоренной идентификации патогенных, условно-патогенных и санитарно-показательных микроорганизмов был предложен широкий ассортимент хромогенных питательных сред. Ведущими мировыми производителями хромогенных и питательных сред были: Merck, Difco-BD, Oxoid, HiMedia. Созданная во Франции фирма «CHROMagar» предложила современному рынку помимо сред для медицинских анализов новые среды для контроля контаминации пищи и окружающей среды: Rambach™агар – хромогенная среда для выявления и выделения Salmonella в пище; CHROMagar™ ECC для выявления E. coli и колиформных бактерий в переработанной и сырой пище, воде, молоке, образцах окружающей среды; AquaCHROM™ неагаровая хромогенная – среда для определения присутствия/отсутствия E. coli и колиформных бактерий в образцах воды (использование к ней двух хромогенов исключает необходимость применения УФ-лампы для оценки результатов: при наличии E. coli цвет среды зелёный, колиформных – жёлтый); CHROMagar™ Vibrio – для выявления V. cholerae, V. parahaemolyticus, V. vulnificus, V. alginolyticus, в морепродуктах и морской воде; CHROMagar™ O157 – для выявления E. coli O157 в срезах мяса и других образцах, полученных от животных и человека; CHROMagar™ Listeria Identific – для выявления L. Monocytogenes в различных образцах; CHROMagar™ Staphaureus – для выделения и прямого определения S. aureus – одного из основных патогенов пищевой индустрии и клиник, колонии которого окрашены в розовый цвет; CHROMagar™ Pseudomonas – для выделения и определения видов Pseudomonas–колоний зелёного цвета; CHROMagar™ Salmonella Plus – для выявления Salmonella – S. Typhi, S. Paratyphi A, лактозоположительных Salmonella в мясе, свежих яйцах, молочной продукции и др.
Среди указанных сред Rambach™ является первой в мире хромогенной средой с установленной чувствительностью 93,7 %. На этой среде отсеивается большое количество ложноположительных результатов. Колонии Salmonella на среде окрашиваются в красный цвет, а колиформные бактерии – в синий или фиолетовый, другие – бесцветные.
В связи с возросшей смертностью от лактозо-положительных видов Salmonella при пищевых отравлениях особую значимость приобрела среда CHROMagar™ Salmonella Plus, чувствительность которой составляет 99 % и которая обеспечивает чёткую идентификацию сальмонелл в течение суток.
В России в НПО «Питательные среды» (г. Махачкала) были сконструированы несколько высокоактивных хромогенных сред (E. coli хром агар – для выделения и прямой идентификации эшерихий; Дагхром агар – для выделения и идентификации кишечной палочки и других колиформных бактерий в воде и пищевых продуктах; E. coliколиформ-Proteus хром агар – для выделения и одновременной прямой идентификации E. coli, колиформных бактерий и протея; Klebsiella хром агар – для выявления клебсиелл и Enterobacteraerogenes [4, 6, 7, 9, 11, 13]. Выпуск этих сред, характеризовавшихся стабильностью биологических свойств микроорганизмов, в настоящее время приостановлен вследствие экономических причин.
У обычных сред для обнаружения Salmonella, как указывают производители, в составе имеются пептоны, дрожжевой экстракт и вещества, которые обеспечивают оптимальные условия для роста сальмонелл, образования сероводорода (тиосульфат и ионы трёхвалентного железа, окрашивающие колонии сальмонелл в чёрный цвет). Но, как известно, в практике на простых селективных средах часто проявляется неудовлетворительная специфика реакций, что приводит к обилию ложноположительных результатов (обнаруживаются Citrobacter Proteus и т.д. в качестве подозрительных колоний среди редких колоний сальмонелл) [11, 12]. В хромогенных средах сальмонеллы продуцируют кислоту из пропиленгликоля, в результате чего происходит изменение pH среды, и колонии сальмонелл окрашиваются в красный цвет. Для дифференциации сальмонелл от колиформных бактерий в состав среды включена хромогенная смесь, которая выявляет наличие фермента ß-галактозидазы фермента, характерного для колиформных бактерий. Колиформные бактерии растут в виде сине-зелёных или сине-фиолетовых колоний. Остальные энтеробактерии и другие грамотрицательные бактерии, такие, как Proteus, Pseudomonas, Shigella, вырастают в виде бесцветно-желтоватых колоний и соответственно бактерии рода Salmonella – в виде красных колоний. Rambach™-агар обеспечивает однозначную дифференциацию сальмонелл от других бактерий [5, 9]. Затраты рабочего времени для проведения ненужной экспертизы подозрительных колоний настолько высоки, что реальные положительные колонии сальмонелл могут быть ошибочно исключены при обычном тестировании.
Чтобы подтвердить положительный результат обычный метод требует дополнительного анализа 10 колоний на 1 подозрительный образец [10, 13].
Целью нашей работы явился сравнительный микробиологический анализ при выявлении бактерий рода Salmonella с помощью хромогенных питательных сред и обычных селективных и неселективных сред.
Материал и методы исследования. В экспериментах использовали следующие среды производства «HiMedia»: забуференная пептонная вода (225 мл); тетратионатный бульон (Мюллера – Кауфмана 10,0 мл); среда Раппапорта – Вассилиадиса с соей (RVS-бульон 10,0 мл); XLD-агар; хромогенная среда Rambach-агар, скошенный столбик мясо-пептонного агара; среда Олькеницкого; набор тест-систем API 20E; посуда одноразовая для микробиологических исследований; пипетки градуированные; дозаторы для разлива питательных сред; дозатор механический одноканальный для проверки с API 20E, петля бактериологическая; пастеровские пипетки, весы лабораторные, ламинарный бокс 2-го класса точности, термостат на 37 °С, термостат на 41,5 °С, стерильная дистиллированная вода [2, 7, 13].
Для проведения исследования были отобраны пробы полуфабрикатов различных торговых марок и производителей из мяса цыплят-бройлеров и индеек. Отбор образцов полуфабрикатов и их микробиологический анализ проводили согласно ГОСТу 31904-2012 «Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических испытаний» [11], ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» [12] и СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» [3]. В полуфабрикатах определяли наличие сальмонелл согласно ГОСТу 31468-2012 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Метод выявления сальмонелл» [5].
Согласно ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» [9] патогенные микроорганизмы, в том числе Salmonella, в 25 г продукта (в мясе и мясной продукции, субпродуктах, шпике свином и продуктах из него) не допускаются.
Для проведения исследования нами были отобраны 35 проб полуфабрикатов из мяса птицы. 25 г образца каждой пробы высевали в забуференную пептонную воду. Посевы инкубировали при температуре (37 ± 1) °С в течение (18 ± 2) час. Культуры из среды для предварительного неселективного обогащения пересевали в две среды для селективного обогащения. Для этого 0,1 см3 культуры пересевали в (10,0 ± 0,1) см3 среды Раппапорта – Вассилиадиса с соей (RVS-бульон), 1,0 см3 культуры пересевали в (10,0 ± 0,1) см3 в тетратионатный бульон (Мюллера – Кауфмана). Посевы на RVS-бульоне инкубировали при температуре (41,5 ± 1,0) °С в течение (24 ± 3) час., на тетратионатном бульоне Мюллера – Кауфмана при температуре (37 ± 1) °С в течение (24 ± 3) час.
Для выделения чистой культуры после инкубирования на селективных средах проводили перенос посевного материала на две агаризованные дифференциально-диагностические среды: на XLD-arap и хромогенный Rambach-агар. Чашки Петри с посевами переворачивали вверх дном, помещали в термостат при температуре (37 ± 1) °С и инкубировали. Предварительный учёт результатов проводили через (24 ± 3) час., окончательный – через (48 ± 3) час.
После инкубирования просматривали чашки Петри, отмечали присутствие типичных или не совсем типичных (подозрительных) колоний (при росте на конкретной дифференциально-диагностической среде) для бактерий рода Salmonella. Отобранные колонии депонировали для проведения последующей идентификации.
Результаты исследования. Для наглядного примера в виде таблицы (табл. 1) привели характерный рост различных грамотрицательных микроорганизмов на XLD-агаре и хромогенном Rambach-агаре.
1. Результаты культивирования энтеробактерий на дифференциальных диагностических средах
Тест-штамм
Колонии на XLD-агаре
Rambach-агар
Salmonella (Typhimurium, Enteritidis)
бесцветные, с чёрным центром
красные
Escherichia coli
жёлтые
сине-зелёные
Proteus mirabilis
жёлтые, с чёрным центром
желтоватые
Shigella flexneri
бесцветные, без
чёрного центра
желтоватые
При классических бактериологических исследованиях с использованием обычных питательных сред, чтобы доказать, что подозрительные колонии принадлежат к Salmonella spp., а не являются бактериями родов Shigella или Proteus, необходимо приготовить мазки, окрасить их по Граму, провести ряд серологических и биохимических исследований, что требует длительной рутинной работы, большого количества времени, а результат не всегда оказывается положительным. Хромогенные среды избавляют бактериологов от проведения рутинных исследований, так как благодаря изменению окраски колоний на этих средах можно узнать о присутствии/отсутствии бактерий рода Salmonella.
Проведённые нами исследования показали, что в семи пробах (образцы № 3, 8, 14, 15, 21, 26, 34) на XLD-агаре выросли типичные колонии сальмонелл (рис. 1).
Рис. 1 – Колонии Salmonella spp. на XLD-агаре – чёрные колонии
На Rambach-агаре только в трёх образцах птицепродуктов (пробы № 8, 15, 34) (рис. 2) выросли розово-красные колонии, характерные для сальмонелл.
Рис. 2 – Колонии Salmonella spp. на Rambach™-агаре:
1 – красные колонии; 2 – БГКП – сине-фиолетовые колонии
В пробах № 3, 14, 21, 26 на Rambach™-агаре выросли жёлто-оранжевые колонии (рис. 3).
Рис. 3 – Proteusmirabilis на Rambach™-агаре:
1 – оранжевые колонии; 2 – Escherichia coli – зелёные колонии
Для дальнейшей идентификации отбирали по пять типичных колоний с каждой чашки, пересевали на чашки с агаром ХLD и Rambach для получения чистых культур. Затем изучали биохимические свойства, проводили посев на среду Олькеницкого. В пробах № 8, 15 и 34 подтвердилось присутствие бактерий рода Salmonella (рис. 4). В пробах № 3, 21, 26 выявлены Proteusmirabilis (рис. 5).
Рис. 4 – Биохимическое подтверждение бактерий рода Salmonella на среде Олькеницкого
Рис. 5 – Биохимическое подтверждение бактерий рода Proteusmirabilis на среде Олькеницкого
Для полной достоверности полученных результатов мы провели биохимический тест с использованием тест-сиcтем API 20E [13], а окончательный результат получили при помощи программы Apiweb, который подтвердил наличие в образцах № 8, 15 и 34 Salmonella spp. 99,9 % (рис. 6), а в образцах № 3, 14, 21 и 26 – Proteusmirabilis 99,9 % (рис. 7).
Рис. 6 – Результаты API 20E Salmonella spp Рис. 7 – Результаты API 20E Proteus mirabilis
Выводы
1. Проведённые исследования птицепродуктов из мяса цыплят-бройлеров и индеек подтвердили, что хромогенные питательные среды упрощают процесс микробиологической экспертизы, обеспечивают высокую точность идентификации, сокращают время на проведение исследования, избавляя от длительной рутинной работы, экономят материалы.
2. Вследствие более чёткого распознавания колоний сальмонелл повышается точность микробиологической идентификации.
3. Целесообразно внести ссылки на промышленные среды, в частности, на питательную среду Rambach™, в различные нормативные документы и ГОСТы, действующие на территории России, что позволит эффективно использовать эту среду в соответствии с нормативами.
Литература
1. Лабинская А.С., Блинкова Л.П., Ещина А.С. (ред.). Общая и санитарная микробиология с техникой микробиологических исследований. 3-е изд. СПб.: Лань, 588 с.
2. Питательные среды для микробиологического контроля качества лекарственных средств и пищевых продуктов: справочник / В.А. Галынкин, Н.А. Заикина, В.И. Кочеровец [и др.] / под ред. В.А. Галынкина, В.И. Кочеровца. СПб.: Проспект науки, 2006.
3. Поляк М.С., Сухаревич В.И., Сухаревич М.Э. Питательные среды для медицинской и санитарной микробиологии. СПб.: ЭЛСИ-СПб, 2008.
4. Шепелин А.П. Сравнительная оценка качества основных питательных сред отечественного и импортного производства // Научно-практический медицинский журнал. 2013. Т. 8. №1. С. 231 – 236.
5. Абдуллаева А.М., Ленченко Е.М., Плотникова И.В. Индикация патогенных бактерий, выделенных из пищевого сырья // Российский журнал проблемы ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. 2019. № 2 (30). С. 190 – 197.
6. Меджидов М.М., Юнусова Р.Ю., Степанова Э.Д. Разработка хромогенной питательной среды для ускорения идентификации E. Coli и других колиформных бактерий в объектах окружающей среды // Журнал микробиологии 2007. № 4. С. 114 – 115.
7. Пат. на изобретение № 2386696 от 20.04.2010 / Меджидов М.М., Степанова Э.Д., Юнусова Р.Ю. и др.
8. Юнусова Р.Ю. Разработка хромогенных питательных сред для выделения и ускоренной идентификации условно патогенных энтеробактерий: дис. … канд. биол. наук. М., 2011. 133 с.
9. Отечественные хромогенные среды для дифференциации клебсиелл / / Р.Ю. Юнусова, В.Г. Горелова, Э.Д. Степанова [и др.] // Журнал клинической лабораторной диагностики. 2010. № 3. С. 49 – 51.
10. ТР ТС 021/2011 Технический регламент Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции».
11. ГОСТ 31468-2012 «Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Метод выявления сальмонелл».
12. СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».
13. ГОСТ 31904-2012 «Продукты пищевые. Методы отбора проб для микробиологических испытаний».
14. Bauer R. et al. Functional expression of bacterial β-glucuronidase and its use as a reporter system in the yeast Yarrowialipolytica. Yeast: 1993, № 9, Issue 1, p. 71 – 75.
15. Hi Media Laboratories Pvt Limited., LBS Marg, Mumbai. India, 2003.
16. Rambach A. New plate medium for facilitated differentiation of Salmonella spp. from Proteus spp. and other enteric bacteria // Appl. Enrionm. Microbiol., 56; 301 – 303 (1990).
17. Gruenewald R., et al.: Use of Rambach Propylene Glycol containing Agar for identification of Salmonella spp // J. Clin. Microbiol.: 2354 – 2356 (1991).
18. Bartolome, R.M., et al. Nuevo media de cultivo para el aislamiento de Salmonella spр. V Congreso de la Sociedad espanola de Immunologiaclinica, Barcelona; November 1992.
19. Laudat P. et al. Rambach Agar: New plate medium for rapid and facilated identification of Salmonella spp. 5 European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases.-Oslo, Norway, p.177; September 9 – 11, 1991.
20. Ossmer R. Salmosyst and Rambach-Agar. A rapid alternative for the detection of Salmonella. Congress-Poster- Salmonella and Salmonellossis-Ploufragen / Sant-Brieux-France, September 1992.
21. Benett A.R. et al. Evalution of Rambach Agar and Salmosyst Enrichment for the isolation of Salmonella from foods. Congress-poster-RAMI, London; September 1993.
22. Cantoni C. et al. Comparazione tra vari terreni selettivi per l’isolamento di Salmonella spp. da funghi biologici e da alimenti. Indegneria Alimentare, 3/93; p. 35 – 43.
№ 2 (82)
